Przeszczepy tkankowe w rekonstrukcji ucha środkowego - metody przygotowania i konserwacji tkanek - Słuchowisko.net

Częstość jednokrotnego przechorowania ostrego zapalenia ucha środkowego oceniana jest na naszej szerokości geograficznej na około 95% populacji. Schorzenie to rzadko ma swoje dalsze implikacje kliniczne. Jednak w kilku do kilkunastu procentach przypadków zapalenie ucha nawraca lub przechodzi w stan przewlekły, czego następstwem może być trwałe uszkodzenie któregoś z elementów układu przewodzącego dźwięki. 

Zabiegi mające na celu czynnościowe i anatomiczne odtworzenie tego układu znane są od stuleci. W obecnej chwili rozwój techniki mikrochirurgicznej i duża znajomość mechanizmów immunologicznych oraz metod konserwacji tkanek, a także doświadczenia nabyte i przekazywane przez wiele pokoleń otochirurgów spowodowały, iż efekty rekonstrukcyjnych operacji ucha środkowego są coraz doskonalsze. Mimo ogromnych postępów w technice operacyjnej, kofochirurdzy wciąż poszukują nowych metod i materiałów odtwórczych.

Początkowo sposoby poprawy słuchu polegały na stosowaniu metalowych tub przykładanych do niedosłyszącego ucha. Pierwszym zabiegiem rekonstrukcyjnym wykonanym w uchu pacjenta z perforacją błony bębenkowej było zastosowanie fragmentu pęcherza moczowego, osadzonego jako przepona (membrana) w tubie z kości słoniowej. Dokonał tego Acidalius Marchius z Wittembergi w 1640 roku. Z kolei Berthold w 1878 roku użył do zamknięcia perforacji w błonie bębenkowej materiału tkankowego: był nim wolny przeszczep własnej skóry pacjenta umocowany opatrunkiem przetrzymywanym przez kilka dni w uchu. Berthold nazwał swój zabieg myringoplastyką i nazwa ta przetrwała do naszych czasów. W celu odtworzenia brakujących lub uszkodzonych fragmentów układu przewodzącego dźwięki stosowano wiele materiałów oraz niemal wszystkie rodzaje tkanek w układzie auto-, allo- i ksenogenicznym¹. Ostatnio coraz częściej stosuje się  połączenia materiałów pochodzenia biologicznego z materiałami alloplastycznymi. Natomiast materiały alloplastyczne coraz chętniej stosowane są do łączenia zachowanych fragmentów kosteczek. Konstrukcje tego typu stanowią cenne uzupełnienie przeszczepów biologicznych. Istotną rolę w chirurgii rekonstrukcyjnej ucha odgrywają również samowchłanialne gąbki fibrynowe, folie silikonowe i teflonowe oraz kleje cjanoakrylowe. Pomagają one w utrzymaniu odtworzonych struktur oraz ułatwiają proces gojenia.
Mimo znacznych możliwości diagnostycznych nadal w chwili przystępowania do zabiegu jedynie w przybliżeniu możemy określić zakres przewidywanej rekonstrukcji aparatu przewodzącego dźwięki. W tym celu na każdym oddziale zajmującym się operacjami tympanoplastycznymi niezbędna jest organizacja tzw. banku tkanek.
Stworzenie banku tkanek dla potrzeb otologicznych nie wymaga specjalnego szkolenia personelu ani konieczności wydzielenia na jego potrzeby dodatkowych pomieszczeń. Może on stanowić integralną część Pracowni Kości Skroniowej. Wydaje się, iż najwłaściwszą formą organizacyjną jest stworzenie pracowni pod auspicjami Centralnego Banku Tkanek. Nawiązanie współpracy z wyspecjalizowanym ośrodkiem, jakim jest centralny bank tkanek, ułatwiałby nadzór specjalistyczny oraz sprzyjał ścisłej współpracy, w tym również szkoleniom personelu i wprowadzaniu nowych technik.
Każdy otiatra powinien przeprowadzić odpowiednią liczbę operacji na kościach skroniowych, stąd niezbędna staje się współpraca z Zakładem Anatomii Patologicznej. Stanowi ona warunek prawidłowego funkcjonowania banku tkanek: pozwala na szybkie powiadamianie o zgonie i umożliwia dostęp do dokumentacji dawcy. Pobierane fragmenty tkankowe są zwykle małe, a ich uzyskanie nie prowadzi do oszpecenia zwłok. Nie wymaga też ścisłego reżimu czasowego, jak ma to miejsce w przypadku pobierania narządów. Tkanki powinny być uzyskane po upływie 12, ale nie dłużej niż po 24 godzinach od zgonu dawcy.
Do rekonstrukcji aparatu przewodzącego dźwięki najczęściej wykorzystywane jest śródoperacyjnie formowane kowadełko, uzyskane w czasie operacji ucha głuchego lub w trakcie operacji destrukcyjnej (radykalnej).

Kryteria selekcji materiałów do przeszczepu

Przy doborze materiałów stosowane są ogólnie przyjęte w transplantologii kryteria.  Pod uwagę nie są brani ci dawcy, u których przed śmiercią rozpoznano czynny proces gruźliczy, chorobę nowotworową, uzyskano dodatnie wyniki testów serologicznych lub pacjent w wywiadzie zgłosił przebytą kiłę, wirusowe zapalenie wątroby bądź cechy zespołu nabytych zaburzeń odporności (AIDS). Wykluczeni są również ci dawcy, u których przed śmiercią rozpoznano inne zaburzenia immunologiczne lub zespoły autoagresji oraz czynną infekcję bądź choroby zakaźne. Przy przeszczepianiu błon bębenkowych lub kosteczek słuchowych ważne jest, by w tkankach ucha dawcy nie było cech czynnego lub przebytego procesu zapalnego. W organizmie biorcy przeszczepione „zrosty” mogą stać się miejscem zmniejszonej oporności.
Dawcami kosteczek słuchowych niejednokrotnie stają się pacjenci poddani radykalnej operacji ucha. W takich przypadkach elementy kostne układu przewodzącego nie są dla nich przydatne z punktu widzenia możliwości odtworzenia lub zachowania funkcji operowanego ucha. Pacjent-dawca jest o fakcie pobrania tych struktur zawsze informowany. Często jednak ma to miejsce dopiero po zakończeniu zabiegu, gdyż potwierdzenie przydatności pobieranych tkanek do przeszczepu jest możliwe jedynie śródoperacyjnie. Uzyskane fragmenty zawsze podlegają selekcji anatomicznej i histologicznej. Do przeszczepów allogennych powinny być używane błony bębenkowe, których warstwa włóknista nie jest grubsza niż 100 - 200 µm. Przeszczepy takie cechuje duża elastyczność oraz łatwość układania ich w miejscu ortotopowym², gdzie warunki operacyjne często są trudne.
Konserwowane błony bębenkowe w pełni zachowują swój kształt oraz łatwo pozwalają układać się pod odpowiednim kątem w stosunku do ścian przewodu słuchowego i łańcucha kosteczek. Daje to większą gwarancję dobrego efektu operacyjnego, zarówno czynnościowego, jak i anatomicznego. Przygotowana do przeszczepu błona bębenkowa, a ściślej jej warstwa środkowa (włóknista), wykazuje różny stopień zmętnienia przy oglądaniu w mikroskopie operacyjnym. Przy pobieraniu fragmentów ucha środkowego w bloczkach kostnych ze zwłok, dość dokładnie można ocenić jej grubość, a zatem i przydatność jako przeszczepu. W mikroskopie operacyjnym błona bębenkowa o grubości średnio 100 - 200 µm po złuszczeniu z jej powierzchni naskórka jest na tyle przezroczysta, że widoczne są szczegóły anatomiczne ucha środkowego. Można również zobaczyć blizny i zniekształcenia, co ułatwia ewentualną dyskwalifikację błony do przeszczepu.

Rola badań bakteriologicznych

Ważną rolę w przygotowaniu przeszczepów odgrywa kontrola bakteriologiczna. Właściwy dobór środka konserwującego w dużej mierze warunkuje sukces leczenia. Najczęściej stosowany jest roztwór cialitu³ w stężeniu 0,02%, który szybko niszczy ziarniaki Gram-dodatnie. Pałeczka ropy błękitnej ulega w nim inaktywacji po 4 - 5 godzinach. Pałeczki Gram-ujemne, takie jak Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Proteus rettgeri, wykazują większą odporność na działanie cialitu i są w stanie przeżyć 24- do 30-godzinny okres inkubacji. Bakterie Bacillus cereus i Bacillus subtilis ulegają inaktywacji dopiero po upływie 5 - 6 dni. Kontrola jałowości fragmentów błon bębenkowych wykonana po 21-dniowej konserwacji w 0,02% roztworze cialitu nie wykazuje wzrostu w żadnej z badanych grup, zarówno w tlenowych jak i beztlenowych warunkach. Konserwacja fragmentów ucha środkowego w roztworze cialitu nie powinna trwać krócej niż od 3 do 4 tygodni i dłużej niż od 3 do 4 miesięcy.

Podział materiałów tkankowych

Fragment kości skroniowej do przeszczepu pobiera się w zależności od jego przeznaczania: jako materiał transplantologiczny lub do ćwiczeń anatomicznych. Ze względu na rozległość rekonstrukcji ucha środkowego stosuje się różne przeszczepy. Można je podzielić na trzy zasadnicze grupy:

I. Błona bębenkowa bez kosteczek słuchowych:
wyłącznie z pierścieniem bębenkowym,
z fragmentem skóry przewodu słuchowego.

II. Błona bębenkowa z kosteczkami słuchowymi:
z młoteczkiem,
z młoteczkiem i kowadełkiem,
z całym łańcuchem kosteczek.

III. Pojedyncze kosteczki słuchowe.

W każdym przypadku, bez względu na to czy do przeszczepu potrzebna jest sama błona, czy też błona z młoteczkiem, podczas preparowania zawsze zachowuje się młoteczek. Oddzielenie błony bębenkowej od pierwszej kosteczki wykonuje się dopiero po konserwacji. Przy pobieraniu błony bębenkowej z młoteczkiem i kowadełkiem bądź ze wszystkimi elementami aparatu przewodzącego przed ich usunięciem należy uwolnić połączenia stawowe oraz przeciąć ścięgno mięśnia strzemiączkowego.

Metody konserwacji przeszczepów

Celem konserwacji tkanek jest zapobieżenie rozwojowi zmian pośmiertnych oraz namnażania flory bakteryjnej. Istotne jest również zmniejszenie antygenowości przeszczepu. Metody konserwacji stosowane dla celów operacji tympanoplastycznych oparte są na doświadczeniach uzyskanych przy konserwacji allogennych kości, ścięgien oraz powięzi. Stosowane w tym celu środki konserwujące w różnym stopniu odpowiadają wymaganiom. W zależności od oddziaływania na tkanki możemy wyróżnić trzy zasadnicze metody konserwacji:

• zachowującą właściwości biologiczne i żywotność przeszczepu,
• zachowującą tylko właściwości biologiczne,
• nie zachowującą właściwości biologicznych ani żywotności przeszczepu.

Metody zachowujące właściwości biologiczne i żywotność tkanek stosowane były do konserwacji świeżych przeszczepów auto- i allogennych. Przeszczepy te nie są już wykorzystywane przy operacjach poprawiających słuch. Czynnikami ograniczającymi ich stosowanie była znaczna antygenowość oraz złe czynnościowe rezultaty operacji. Druga grupa metod obejmuje zamrażanie oraz liofilizację.  Ich wadą jest zachowanie znacznych własności antygenowych przechowywanej tkanki. Konserwacja w 70% etanolu, podobnie jak w 1% lub 4% roztworze formaldehydu nie zachowuje właściwości biologicznych ani żywotności przeszczepu. Środki te nie są już stosowane przy przygotowaniu i przechowywaniu przeszczepów ucha środkowego. Najbardziej atrakcyjna, poza roztworem cialitu, wydaje się obecnie konserwacja w 0,5% wodnym roztworze glutaraldehydu. Sprawia on, że tkanki zachowują swoją sprężystość, kształt i wytrzymałość: są jednak bardziej podatne niż po konserwacji w roztworze formaldehydu. Aldehyd glutarowy, w porównaniu z formaldehydem, zachowuje większą ilość połączeń między białkami, dlatego wytrzymałość mechaniczna, termiczna i enzymatyczna wszczepów jest większa.
Konserwacja w 0,02% roztworze cialitu wydaje się nadal najlepszym sposobem przechowywania kosteczek słuchowych i błon bębenkowych oraz jedną z najlepszych metod konserwacji tkanek miękkich. Właściwości cialitu można zebrać następująco:

• pozbawia tkanki właściwości immunogennych,
• nie uszkadza włókien kolagenowych,
• sterylizuje konserwowany materiał,
• łatwo wypłukuje się z tkanek,
• nie zmienia właściwości elastycznych tkanki łącznej włóknistej.

Konserwacja przeszczepów dla celów otologicznych powinna być prowadzona w warunkach aseptycznych wodnym roztworem cialitu w rozcieńczeniu 1:5000. Wypreparowany i utrwalony fragment przeszczepu zanurza się w roztworze cialitu w proporcji od 1/3 do 2/3. W ciągu pierwszych dwóch tygodni roztwór należy zmieniać co 2 - 3 dni i przetrzymywać w temperaturze 4°C. Przechowywanie tak przygotowanych tkanek nie powinno przekraczać 3 miesięcy.
Cialit i formaldehyd należą do środków powodujących denaturację białka. Cialit łączy się z białkami w sposób trwały tworząc nierozpuszczalne i nietoksyczne związki. Konserwacja tym środkiem powoduje zniszczenie największej liczby komórek warstwy włóknistej błony bębenkowej, zmniejszając tym samym jej antygenowość. Przechowanie przeszczepów w roztworze cialitu przez ponad trzy tygodnie sprawia, że w preparatach w ogóle nie znajduje się komórek. Resztki uszkodzonych podczas konserwacji komórek usuwane są w czasie płukania przeszczepów w fizjologicznym roztworze soli przed przystąpieniem do zabiegu operacyjnego.

Przygotowana do przeszczepu błona bębenkowa posiada jedynie część środkową (włóknistą). Warstwy naskórkowa i wyściółkowa zostają „zniszczone” w czasie konserwacji bądź usunięte mechanicznie za pomocą narzędzi chirurgicznych.

Warstwa włóknista błony bębenkowej składa się z włókien kolagenowych, istoty międzykomórkowej oraz komórek tkanki łącznej. Swoją budową przypomina zatem inne rodzaje tkanki łącznej, takie jak ścięgna oraz powięzie. Wymienione tkanki posiadają znikomą ilość komórek. Ponieważ przebieg reakcji immunologicznej w dużym stopniu zależy od ilości wprowadzanych do organizmu biorcy obcych komórek, w przypadku przeszczepiania konserwowanej błony bębenkowej reakcja ta powinna być znikoma. Liczba komórek, które nie uległy zniszczeniu i wypłukaniu podczas konserwacji, w dużej mierze zależy od rodzaju i techniki przygotowania przeszczepu. Przeszczepy kolagenowe, a tym samym i błony bębenkowe, powodują znikomą reakcję immunologiczną. Można oceniać ich antygenowość w zależności od rodzaju użytego środka konserwującego. Wyniki badań wykazują, że obce gatunkowo przeszczepy błon bębenkowych są materiałem antygenowym zdolnym do wytworzenia rakcji blastycznej w regionalnym węźle chłonnym. Węzły te wykazują bowiem statystycznie znamienny wzrost liczby komórek blastycznych w stosunku do węzłów kontrolnych. Natomiast przeszczepy takich samych błon bębenkowych konserwowanych w cialicie nie wywołują statystycznie istotnego wzrostu odczynu blastycznego w regionalnych węzłach chłonnym. Wynika stąd wniosek, że konserwacja w cialicie znacznie obniża antygenowość przeszczepianych błon bębenkowych.
Poza techniką przechowywania przeszczepów w roztworze cialitu i formaldehydu, możliwe jest również pozostawienie kosteczek w autoklawie przez okres 30 minut w temperaturze 125°C. Tak przygotowany przeszczep może być szczególnie przydatny przy odtwarzaniu lub substytucji któregoś z fragmentów łańcucha kosteczek słuchowych.

Mechanizm wgajania się przeszczepów

Przeszczepianie konserwowanych błon bębenkowych sprowadza się w zasadzie do przeszczepienia ich warstwy włóknistej. Umieszczona w organizmie biorcy tkanka stanowi jak gdyby rusztowanie, po którym następuje „pełzanie” komórek gospodarza, a następnie wnikanie ich w głąb przeszczepu. Zjawisko to nosi nazwę zastępowania napełzającego lub indukcji asymilacyjnej. W trakcie wygajania się przeszczepu błony bębenkowej, na jego powierzchnię wnikają komórki nabłonka ze skóry przewodu słuchowego biorcy. Przyjmując, że naskórek odradza się z szybkością około 0,5 milimetra na dobę, należy przypuszczać, iż całkowite pokrycie błony bębenkowej następuje po kilkunastu dniach. Podobnie od strony jamy bębenkowej napełzają na przeszczepioną błonę komórki wyściółki. W głąb warstwy włóknistej wnikają fibroblasty mające zdolność produkowania włókien kolagenowych. Nowo powstałe włókna stopniowo zastępują włókna przeszczepu, które ulegają powolnej degradacji. Odtworzona w ten sposób błona bębenkowa posiada tę samą budowę i właściwości, jakie posiada zdrowa błona bębenkowa. Wymiana włókien kolagenowych w przeszczepionej tkance odbywa się dość wolno, bowiem jeszcze po 26 tygodniach od dnia operacji stwierdza się w niej obecność "starych” włókien. Trudny jest także do określenia - nawet w przybliżeniu - czas, po którym wszystkie włókna ulegają całkowitej wymianie. Zależy to bowiem od rodzaju tkanki łącznej, wieku pacjenta i sposobu przygotowania przeszczepu. Kolagen osób młodych charakteryzuje się wyższą aktywnością biologiczną niż u ludzi starszych. Należy więc sądzić, że u osób młodych wymiana kolagenu zachodzi szybciej również i w przeszczepach. Wydaje się, że mechanizm wygajania się kosteczek słuchowych jest taki sam, jak i innych przeszczepów kostnych. Z klinicznego punktu widzenia allogenne, konserwowane przeszczepy kosteczek są dobrze tolerowane przez organizm, jednak ich obecność u biorcy wiąże się z kilkoma zagadnieniami. Podobnie jak w przypadku przeszczepu błony bębenkowej, występuje problem antygenowości oraz rewitalizacji i resorpcji kości. Jeżeli któraś z kosteczek zostaje przeszczepiona w obręb mięśni w układzie allogennym, reakcje immunologiczne są jeszcze wyraźniejsze. Jak dotąd nie ma zgodnej opinii, co do przebiegu procesów osteogenezy kosteczki przeszczepionej do przestrzeni ucha środkowego. Początkowo sądzono, że kosteczki wszczepianie w miejsce heterotopowe, a szczególnie w obręb mięśni, szybciej ulegają resorpcji z powodu większego kontaktu wszczepu z tkankami otoczenia. Przypuszczano, że szybkość resorpcji przyspiesza lepsze ukrwienie mięśni, w mechanizmie łatwiejszej penetracji komórek jednojądrzastych w głąb przeszczepu.
Jak się jednak wydaje, czynnikiem decydującym o przebiegu procesu gojenia się przeszczepionych kosteczek nie jest miejsce wszczepu, a sposób konserwacji. Kosteczki konserwowane w roztworze formaliny lub trzymane w autoklawie (w temperaturze 125°C przez 30 minut), nie wykazują cech kościotworzenia nawet po okresie kilku miesięcy, zarówno przy wszczepieniu ich do mięśni, jak i w miejsce ortotopowe.
Wielkość ognisk kościotworzenia w kości konserwowanej w dużej mierze zależy od aktywności komórek gospodarza i tempa ich transformacji w kierunku komórek kościotwórczych. W obrębie wszczepu nie ma komórek ani substancji, które byłyby odpowiedzialne za szybką osteogenezę i procesy transformacji komórkowej. Zauważono, że jeśli w czasie konserwacji struktura przeszczepianej tkanki nie ulega zmianie, na przykład pod wpływem formaldehydu, wówczas procesy kościotworzenia są minimalne. Zatem po odwapnieniu kości, gdy struktura macierzy przeszczepianej kości zostaje zmieniona, komórki tkanki łącznej znacznie łatwiej mogą wnikać do wnętrza przeszczepu. Właściwości antygenowe przeszczepu także ulegają zmianie pod wpływem konserwacji, dlatego wybór techniki i rodzaju środka konserwującego w znacznej mierze decydują o stopniu tej reakcji. Konserwacja w roztworze formaldehydu i zamrażanie nie osłabiają antygenowości przeszczepu. Reakcję tę nieco zmniejsza konserwacja w 70% alkoholu etylowym, zaś prawie całkowicie eliminuje konserwacja w roztworze cialitu i gotowanie w autoklawie w temperaturze 125°C przez 30 minut.

Sukcesy klinicznego stosowania przeszczepów tkankowych w znacznej mierze zależą od techniki konserwacji tkanek. Jak się przypuszcza, sposoby przygotowania przeszczepu w niewielkim stopniu zmieniające strukturę białek, z reguły wyzwalają silną reakcję immunologiczną. Wybór odpowiedniej metody nabiera szczególnego znaczenia w rekonstrukcji aparatu przewodzącego dźwięki, wpływając na anatomiczne i czynnościowe rezultaty operacji tympanoplastycznych. Zastosowanie właściwej techniki przygotowania przeszczepów jest zatem niezwykle ważnym elementem wpływającym na zachowanie się tkanek w organizmie biorcy.

¹ Przeszczep autogenny oznacza przemieszczenie własnych tkanek pacjenta w obrębie jego organizmu. Przeszczep allogenny oznacza przemieszczenie tkanek między osobnikami tego samego gatunku. Przeszczep ksenogenny polega na przemieszczeniu tkanek między osobnikami różnych gatunków.

² Przeszczep heterotopowy oznacza umieszczenie tkanki w organizmie biorcy w innym miejscu niż jej prawidłowa lokalizacja anatomiczna. Miejsce ortotopowe odpowiada prawidłowej lokalizacji przeszczepu w organizmie biorcy.

³ Sól sodowa kwasu 2-etylo-merkapto-5-benzoksazolowego.

PIŚMIENNICTWO:

1. Afanassieff A., Duval G.: La Presse Medicale, 1967, 75, 349.
2. Austin D.F.: Laryngoscope, 1982, 92, 527-530.
3. Bocca E., Cis C., Zernotti E.: Arch. Ital. Otol., 1959, 40, 205, 70 supp.
4. Chalat N. I.: Harper Hosp. Bulletin. Detroit, 1964, 22, 1.
5. Goodman W. S.: Laryngoscope 1971, 81, 1819.
6. Kukwa A., Janczewski G.: Otolaryngologia Polska, 1972, 26, 583.
7. Kukwa A., Jadzikowska-Szlezyngier G.: Otolaryngologia Polska, 1986, 16, 240-242.
8. Kukwa A., Więcko J., Hinek A., Kurnatowski W.: Acta Med. Pol. 1977, 18, 19.
9. Namysłowski G., Gierek T.: Otolaryngologia Polska, 1994, XLVIII, 2.
10. Negri M.: Arch. Stal. O.R.L., 1955, suppl. 22, 7.
11. Ostrowski K., Zaleski M., Rymaszewska-Kossowska T.: Arch. Immun. Ther. Exper., 1969, 17, 342.
12. Smith G.W., Overton S.B.: Laryngoscope, 1968, 78, 1002-1010.
13. Yamanaka E., Yanagihara N., Nakajima T., Ebichara M.: Transplants and Implants in Otology Red. G. Babighian. Amsterdam, 1988, 305-315.
14. Zaleski M., Włodarski K.: Bank Kostny. W: Przeszczepianie i konserwacja tkanek w klinice człowieka (pod redakcją K. Ostrowskiego). PZWL, Warszawa 1964.